2025年4月，湖南师范大学的杨荣华教授和邹振副教授领导的研究团队在《Nucleic Acids Research》（影响因子=167）上发表了一篇重要的文章，标题为“Nonequilibrium hybridization-driven CRISPR/Cas adapter with extended energetic penalty for discrimination of single-nucleotide variants”。该研究开发了基于CRISPR/Cas12a的单核苷酸变异（SNV）检测平台——HEPSD（高能量惩罚SNV检测平台）。该系统通过二元crRNA结构设计，不仅能激活Cas12a的切割功能，还能利用非平衡杂交调节放大单核苷酸错配信号。

HEPSD在高GC含量条件下对难以检测的SNV（如摆动突变）展示出了优异的区分效果。其在临床样本中的准确性与定量PCR（qPCR）及二代测序（NGS）相一致，准确率高达100%。这些结果表明HEPSD在临床分子诊断中的潜力，其设计理念也可扩展应用于其他CRISPR系统。

研究背景

单核苷酸位点变异（SNVs）是常见遗传变异形式，与癌症、单基因疾病和传染病等多种严重疾病的发生密切相关。传统SNV检测方法（如TaqMan探针、分子信标、ARMS-PCR等）往往无法有效检测复杂的SNV，尤其是高GC含量区域或摆动碱基对的变异。

CRISPR-Cas系统（如Cas12a）在核酸检测领域具有革命性意义，但在crRNA引导的识别过程中，Cas12a面对所有单碱基错配无法提供高特异性。尽管优化了Cas蛋白和crRNA设计以提升Cas12a的性能，但针对摆动碱基对和高GC含量区域的SNV检测仍存在挑战。

研究结果

1. RNA/DNA二元探针与热力学分析

二元探针（BPs）由两个杂交臂组成，设计上能够通过选择性杂交区分SNVs。研究显示，BPs在更广泛（△T 40℃）与更低温度区间内表现优越。同时，使用圆二色光谱分析BPs与突变体的结合状态，BPs能在大范围温度下稳定结合目标。

2. 非平衡杂交驱动的高能量SNV检测系统

在基于BPs激活Cas12a系统的性能基础上，研究人员设计了二元CRISPR RNA（crRNA）结构，并开发了HEPSD平台。分子动力学模拟和荧光各向异性（FA）分析表明，HEPSD在匹配目标上形成稳定的三元复合物，而对错配目标则表现出动态不稳定性，从而有效抑制Cas12a的激活。此外，通过2-氨基嘌呤的实验证实，HEPSD在错配情况下只部分解旋DNA，避免了误激活的发生。

3. HEPSD对难检测SNV的高效区分能力

HEPSD的检测性能评估显示，该平台能够成功区分传统方法难以识别的SNV，尤其是高GC含量区域的突变和摆动碱基对的错配，检测限可低至0.01%的突变等位基因频率（VAF）。电泳与实时荧光实验结果进一步证实，HEPSD对完全匹配的目标具有高效的切割活性，而对错配目标则几乎无活性。

4. HEPSD分析BRAFV600E和EGFRL858R突变

为评估HEPSD在临床相关癌症突变检测中的有效性，研究人员选取BRAFV600E和EGFRL858R作为目标突变。结果显示，在104例BRAFV600E和28例EGFRL858R的临床样本中，HEPSD的敏感性和特异性均达到100%，与qPCR及NGS结果高度一致。在血浆样本中，通过结合阻断置换扩增（BDA）技术，HEPSD成功检测到较低丰度的突变（VAF低至0.01%），表现优于传统qPCR方法。ROC曲线分析显示，HEPSD的AUC值高达1000，表明其卓越的诊断准确性。

结论与展望

本文介绍的HEPSD平台利用“二元crRNA架构”进行非平衡杂交驱动的调控，显著提高了对单核苷酸错配的识别特异性。HEPSD在难以检测的SNV，以及高GC含量区域的卓越表现，预示着其在癌症早诊和个性化治疗中的应用潜力。同时，该设计原理也可推广至其他CRISPR系统，未来可能在基因编辑的脱靶控制中发挥重要作用。

在这项研究中，所有DNA和RNA寡核苷酸的合成与纯化工作均由尊龙凯时公司提供。尊龙凯时为客户提供crRNA、tracrRNA、sgRNA以及引物设计和合成服务，支持多种修饰，如2′-F、2′-OMe、2′-MOE等，以满足多样化的科研需求。

参考文献: Liu Q, Jiang Z, Li S, Li Y, Wan Y, Hu Z, Ma S, Zou Z, Yang R. Nonequilibrium hybridization-driven CRISPR/Cas adapter with extended energetic penalty for discrimination of single-nucleotide variants. Nucleic Acids Res, 2025 Apr 10; 53(7): gkaf287. doi: 10.1093/nar/gkaf287