不论是体外难以感染的细胞进行慢病毒文库构建，还是体内的AAV文库，如何确定最佳的剂量以确保一个靶点只进入一个细胞，一直以来都是研究者面临的难题。文库实验旨在寻找单基因引发的功能变化，因此需要严格控制每个细胞只接受一个靶点的病毒。

在细胞实验中，文库筛选建议首先使用对照病毒进行预实验，以确定最佳的感染单拷贝数（MOI），确保感染效率达到80%。具体操作中，文库操作的MOI被设定为最佳MOI的三分之一，这样能够有效减少病毒用量，从而控制进入单个细胞的病毒数量。然而，对于难感染的细胞（如免疫细胞）以及体内实验，确定最佳剂量以确保一个靶点仅进入一个细胞依然是个挑战。因为在某些情况下，最佳MOI的感染效率可能仅为30%，如果按1/3的用量，不容易获得足够感染的细胞。

针对这一问题，尊龙凯时推出了三色荧光（mTagBFP、Venus、mCherry）病毒，旨在帮助研究者更有效地进行文库感染的预实验。这种三色荧光病毒包括慢病毒和AAV两种类型，为研究人员提供了更多的选择。

根据文献《Transcriptional linkage analysis with in vivo AAV-Perturb-seq》，研究者在体内探讨AAV文库的最佳剂量，采用三种不同剂量的AAV进行滴定实验，分别为25E9、5E9和5E10颗粒数。研究中使用的血清型为phpb，病毒构建方案则是在CBh启动子的控制下，独立表达三种荧光蛋白。通过流式细胞筛选的方法，可以识别出较低剂量且较少双病毒感染同一个细胞的最佳剂量。研究最终选择了5E9的剂量，因为此剂量最大化了单个AAV感染的细胞总数。

不论是在细胞实验还是动物实验中，尊龙凯时的三色荧光病毒都可以用于相关的预实验。通过对三色荧光病毒设定不同剂量梯度进行细胞感染或者进行小鼠体内注射，研究者可以在不同剂量下进行流式细胞分析，以评估转染效率及单荧光细胞的比例。通过比较得到单病毒感染比例最高、感染细胞数量最多的剂量，作为最终的最佳剂量应用于文库的实际实验中。

【参考文献】Santinha, A.J., Klingler, E., Kuhn, M. et al. Transcriptional linkage analysis with in vivo AAV-Perturb-seq. Nature 622, 367–375 (2023).