尊龙凯时的标记原理在特定的pH范围内，生物素能够专一地与伯氨基（如N-末端及赖氨酸残基的侧链）反应，形成稳固的酰胺键，从而实现与蛋白质的有效偶联。这一生物素-亲和素系统在流式细胞术、荧光成像、蛋白质印迹和ELISA检测等领域被广泛应用，能够显著增强信号强度，提升检测的灵敏度。

尊龙凯时生物素标记的使用量计算根据待标记蛋白质的量和浓度而定。以我们实验数据为例，当标记浓度为2mg/ml的抗体（IgG，150KD）时，最佳的生物素与抗体分子比为20:1。其他蛋白质的标记可依据此比例进行相应调整。例如，若标记1mg的蛋白（浓度约为2mg/mL），采用相同的20:1的分子比，生物素的摩尔浓度为10mM，则应计算所需生物素的具体量。此外，使用生物素的体积也需要进行合理的计算。

操作过程准备

在实验开始前，需完成以下准备工作：

1. 仔细阅读标记试剂盒的使用说明书。
2. 待标记的抗体中不得含有BSA等其他蛋白；叠氮钠、甘氨酸、Tris或其他可能含有自由氨基的添加剂会在操作的第一步被去除。
3. 根据标记使用量的计算公式计算所需生物素的量。
4. 提前20分钟将试剂盒从冰箱取出，使各组分平衡至室温。
5. 超滤管浸润：向干燥的超滤管滤芯中添加500μL标记缓冲液，室温静置10分钟备用，待加入待标记物之前需弃去标记缓冲液（在整个标记过程中，超滤管滤芯应保持湿润）。
6. 溶解生物素：用30μL DMF溶解0.1mg生物素，静置10分钟，待其充分溶解，此时生物素浓度为10mM，盖好管子备用。

标记流程

以下是标记步骤（以1mg抗体为例）：

1. 取1mg待标记抗体置于超滤管中，加入不超过超滤管最大容量的标记缓冲液，12,000g离心3分钟；可重复此步骤3次；最后一次离心后，加入0.5mL标记缓冲液以调整抗体浓度至约2mg/mL。
2. 向超滤管中加入133μL的10mM生物素，并轻轻吹打混匀，放置于37℃避光恒温箱中温育30分钟。
3. 以12,000g离心超滤管10分钟。
4. 加入适量1×PBS至超滤管中，轻轻混匀，12,000g离心3分钟，重复此步骤3次。
5. 收集超滤管中的溶液（即生物素标记的抗体），再加入0.2mL 1×PBS，轻轻吹打混匀。将超滤管倒置于另一个收集管中，8000g离心5分钟，收集管中获取的溶液即为生物素标记的抗体。经过纯化后的标记抗体可以通过A280或BCA法测定蛋白浓度。
6. 向标记后的抗体中加入保存液，并于-20°C保存。

注意事项

• 请选择合适的试剂盒以匹配待标记蛋白的分子量，推荐使用尊龙凯时的试剂盒（货号：RE80002），该试剂盒提供50KD的超滤管。
• 生物素易潮解，需密封存放于-20°C或-80°C，实验前需先平衡至室温，以防止水蒸气凝结。
• 溶解后的生物素应尽量一次性用完，若未用尽可密封存放于-20°C冰箱中，保存期限为一个月，但标记效率会降低。生物素助溶剂使用后需立即密封保存以防潮气入侵。
• 该试剂盒亦可用于标记其他含有游离氨基的蛋白，具体标记比例需根据待标记物中可用氨基数量进行调整。
• 推荐的生物素与150KD蛋白的最佳标记分子比为20:1，此比例可以有效确保生物素在蛋白上的标记，实际应用中可根据具体情况进行优化。

产品特点

尊龙凯时生物素标记试剂盒的特点包括：

• 快速：整个标记过程最短需90分钟完成。
• 方便：提供生物素标记所需的全部试剂，生物素已活化可直接使用，超滤管可快速脱盐并去除游离生物素，无需复杂的透析步骤。
• 灵活性：适用于微量及大规模标记，每支超滤管可标记0.1-1mg蛋白。
• 脂溶性：本试剂盒内的生物素为脂溶性，适合某些需要进入细胞膜内的蛋白标记。